Chất Lượng Mang Tới Thành Công
1. Những phương pháp cơ bản trong phòng thí nghiệm
Những phương pháp cơ bản trong phòng thí nghiệm giúp đánh giá tình trạng sức khỏe tôm nuôi và phán đoán những nguyên nhân có thể gây bùng nổ bệnh. Có khi việc chẩn đoán chính xác có thể được thực hiện chỉ trong một thời gian ngắn. Những phương pháp này có thể được thực hiện ngay tại trại nuôi tôm hay chỉ cần có kính hiển vi và các dụng cụ tiểu phẩu đơn giản là có thể thực hiện được.
a. Kính phết huyết tương dùng để kiểm tra hình thái của hồng cầu và sự hiện diện của vi khuẩn và ký sinh trùng trong máu. Những biến đổi như nhân bị co lại thường có liên quan đến bệnh Vibrio hoặc bệnh đầu vàng. Nhân bị vỡ và có nhiều thể vùi trong tế bào chất là biểu hiện đặc trưng của sự nhiễm virus gây bệnh đầu vàng (yellow head virus - YHV). Tuy nhiên sự vắng mặt của thể ẩn cũng không loại trừ trường hợp tôm bị nhiễm virus. Vi khuẩn Vibrio thường phổ biến trong các trường hợp nhiễm khuẩn. Vi bào tử trùng (Microsporidium) cũng thường được tìm thấy trong máu. Có thể nhuộm mẫu huyết tương bằng phương pháp nhuộm Gram, nhuộm Wright hay nhuộm Heamatoxyline & Eosin (H&E)
b. Cố định mang tôm bằng dung dịch HCl Davidson và nhuộm bằng thuốc nhuộm H&E có thể phát hiện virus gây bệnh đốm trắng (white spot syndrome virus - WSSV), YHV và virus gây hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô (Infectious Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Virus - IHHNV). Vi khuẩn gây bệnh đóng rong, nguyên sinh động vật, nấm mycosis và hiện tượng tiết hắc tố cũng được phát hiện bằng cách này
c. Quan sát tiêu bản tươi bằng cách lấy mẫu của mang, phụ bộ hay bất kỳ bộ phận nào cần quan sát mà không làm chết tôm cho vào một giọt dung dịch 2.8% NaCl hoặc nước biển vô trùng, đậy bằng lam và quan sát dưới kính hiển vi để phát hiện vi khuẩn dạng sợi, nguyên sinh động vật, vi khuẩn hình que có khả năng di động (thường là nhóm Vibrio), nấm mycosis, diatom, tảo lục và cả mùn bả hữu cơ. Ở những chổ bị đen dưới vỏ hoặc trong cơ có thể dùng dao tiểu phẫu để cắt mẫu và đặt mẫu lên phiến kính với một giọt dung dịch 2.8% NaCl và quan sát dưới kính hiển vi để phát hiện vi khuẩn gây bẩn, nguyên sinh động vật và nấm Furasium.
2. Phương pháp phân lập và định danh vi khuẩn
Đối với nhóm vi khuẩn gây bẩn: việc xác định vi khuẩn gây bẩn không đòi hỏi đến thao tác nuôi cấy mà chỉ cần quan sát tiêu bản tươi các phụ bộ tôm dưới kính hiển vi hay bằng phương thức mô học. Việc định danh đến mức loài thường không cần thiết vì chúng không liên quan đến khả năng gây bệnh của nhóm vi khuẩn này. Vi khuẩn gây bẩn thường được dùng như là các chỉ thị về chất lượng nước kém và tình trạng sức khoẻ tôm không tốt.
Trường hợp vi khuẩn Vibrio thường đòi hỏi thao tác phân lập và nuôi cấy trên môi trường chọn lọc TCBS. Nhóm vi khuẩn Vibrio phát quang còn được phân lập trên một trường phát quang. Có rất nhiều phương pháp hiện hành được sử dụng để định danh vi khuẩn Vibrio đến mức loài (PCR, RFLP, AFLP…) hoặc định typ (multiplex PCR, lai ADN…) để nghiên cứu dịch tể của bệnh do nhóm Vibrio gây ra. Tuy nhiên phương pháp định danh bằng các phản ứng sinh hoá truyền thống vẫn còn có giá trị nhất định nhằm xác định một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hoá của các dòng vi khuần Vibrio phân lập từ tôm bệnh.
3. Phương pháp mô học
Phương pháp mô học nghiên cứu cấu trúc mô ở mức độ hiển vi và mô bệnh học là một chuyên môn hẹp của phương thức mô học đề cập tới quá trình phát triển bệnh. Mô bệnh học là một kỹ thuật rất quan trọng trong nghiên cứu bệnh tôm và nhiều trường hợp bệnh chỉ có thể chẩn đoán được bằng phương pháp này. Tuy nhiên, phương pháp này cũng có những hạn chế, chẳng hạn, thao tác tương đối chậm mà trong nhiều trường hợp bệnh tôm cần phải được xử lý ngay trước khi có được kết quả xét nghiệm mô học. Phương thức mô học chỉ nên sử dụng kết hợp với tất cả các dữ liệu về môi trường và sức khỏe tôm để xác định tác nhân gây bệnh Trước khi quan sát dưới kính hiển vi, mẫu phải được cố định để tránh bị hư thối, loại bỏ thức ăn và đúc khối sáp. Cắt mẫu thành từng lát mỏng khoảng 3-4 mm, rồi đặt lên lam, nhuộm màu và đậy bằng lam kính. Thịt tôm bị phân hủy cực kỳ nhanh sau khi tôm chết, vì thế cần phải cố định chúng. Tôm chết dù được giữ trong nước đá hay đông lạnh đều cũng vô ích đối với phương pháp mô học do những biến đổi xảy ra trong cơ. Dung dịch cố định tôm tốt nhất là Davidson và formaline đệm trung tính.
4. Phương pháp tạo phản ứng chuỗi nhờ polymerase (PCR)
Nguyên tắc của phương pháp PCR
Tất cả các ADN polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch ADN mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn ADN ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn, và ADN polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Phương pháp PCR đã được hình thành dựa vào đặc tính đó của các ADN polymerase. Nếu cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự ADN, ta sẽ chỉ tổng hợp đoạn ADN nằm giữa hai mồi. Điều đó có nghĩa là để khuếch đại một trình tự ADN xác định, ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự đó đủ để tạo các mồi bổ sung chuyên biệt.
Các hạn chếcủa phương pháp PCR
Do độ nhạy rất cao của phương pháp PCR đồng thời với thao tác rất đơn giản, người ta có khuynh hướng sử dụng phương pháp này để giải quyết nhiều vấn đề. Tuy nhiên, ta không thể quên rằng phương pháp có nhiều mặt hạn chế và đòi hỏi sự thận trọng, đặc biệt khi tiến hành thí nghiệm cũng như khi phân tích kết quả. Có thể kể đến ba vấn đề lớn khi sử dụng phương pháp PCR:
- Trong thực nghiệm, kích thước của trình tự cần khuếch đại là giới hạn đầu tiên: trừ vài trường hợp rất cá biệt, phương pháp PCR không hoạt động được với những đoạn ADN lớn hơn 3 kb. Việc sử dụng PCR đối với các độ dài dưới 1.5 kb cho kết quả tốt. Với những độ dài lớn hơn, điều kiện tối ưu cho phản ứng phải được xác định qua thực nghiệm.
- Sự ngoại nhiễm: là vấn đề lớn nhất đặt ra đối với phương pháp PCR, gắn liền với khả năng khuếch đại bản sao của phương pháp này. Đây là vấn đề đặc biệt cấp thiết trong những ứng dụng về chẩn đoán, dự phòng vì hậu quả có thể rất nghiêm trọng. Nguồn ngoại nhiễm lớn nhất thường là các sản phẩm khuếch đại của những lần thao tác trước. Người ta đã chứng minh được rằng việc mở nắp các ống nghiệm sau mỗi lần khuếch đại trong một khoảng không gian kín như phòng thí nghiệm sẽ khiến cho các phân tử đã được khuếch đại thoát ra khỏi ống nghiệm bay lơ lửng trong không khí và bám vào tường, cửa, thiết bị, dụng cụ... rồi nhiễm vào các phản ứng tiến hành sau đó.
- Các sai sót gây ra do taq polymerase: sự sao chép bởi taq polymerase cho tỉ lệ sai khá cao (10-4, nghĩa là cứ 10.000 nucleotide thì enzyme gắn sai 1 nucleotide). Đặc tính này không nghiêm trọng nếu ta chỉ cần xem xét kích thước hay sự có mặt của một sản phẩm khuếch đại. Nhưng có ý nghĩa lớn nếu cần xác định chính xác trình tự nucleotic của ADN ta không thể loại bỏ hoàn toàn các sai sót này mà chỉ có thể giảm bớt; ví dụ như đảm bảo sự cân bằng nồng độ các nucleotic trong phản ứng, xác định trình tự của nhiều sản phẩm khuếch đại từ nhiều thao tác riêng biệt, so sánh trước khi đi đến trình tự chính thức, vv.
Hỗ trợ kỹ thuật : 098 777 36 45 ( Mr Quang )
